Il primo ingrediente alimentare da agricoltura cellulare sottoposto a richiesta di autorizzazione come novel food ha ottenuto un’opinione scientifica favorevole da parte di EFSA (European Food Safety Authority). La tecnologia innovativa è in questo caso applicata al mondo vegetale, al fine di produrre un integratore alimentare con funzione anti-aging. (1)
1) Cellule staminali vegetali
Le piante sono in grado di produrre, nei tessuti meristematici (i.e. all’apice di fusti e radici), cellule staminali che sono dotate della capacità innata di indifferenziarsi. La loro rigenerazione cellulare per mitosi consiste nella divisione in due cellule, una delle quali rimane meristematica, cresce e si prepara a una nuova divisione, mentre l’altra è destinata a differenziarsi per entrare a far parte dei tessuti specifici della pianta. Esse sono perciò chiamate ‘cellule totipotenti’. (2)
Le cellule staminali vegetali vengono sottoposte a coltura, o agricoltura cellulare, per essere propagate e ottenere sia piante o tessuti vegetali, sia cellule specifiche da cui ottenere ed estrarre singoli metaboliti. Quali ad esempio i composti fenolici (3) – sostanze bioattive con azioni antiossidanti, anti-infiammatorie e protettive – dalle enormi potenzialità nella produzione di ingredienti funzionali (a uso alimentare, farmaceutico e cosmetico).
2) Utilizzo di cellule staminali vegetali negli integratori alimentari
Mibelle Group Biochemistry (CH) aveva presentato, il 14 aprile 2020, una domanda di autorizzazione all’immissione sul mercato UE di un integratore alimentare destinato alla popolazione adulta, ottenuto dalla biomassa prodotta mediante coltura cellulare di mele della varietà Uttwiler Spätlauber.
L’ingrediente oggetto della richiesta di autorizzazione novel food, PhytoCellTec™ Md Nu, viene già utilizzato da Mibelle Group Biochemistry – impresa specializzata nella produzione di ingredienti per l’industria cosmetica e nutraceutica – nella produzione di cosmetici con funzionalità anti-aging e di nutrimento della pelle. (4)
La scelta della varietà è legata alle elevate capacità di conservazione, che permettono alla buccia del frutto di non avvizzire, e di non perdere le foglie neanche nei rigidi periodi invernali. Il nome Uttwiler è il nome del villaggio ove è stata scoperta la varietà, mentre Spätlauber significa ‘fogliame tardivo’.
3) Coltura di cellule vegetali, il processo
L’agricoltura cellulare nel regno vegetale prende il via dall’espianto di una porzione di tessuto della pianta prescelta, la cui ferita genera una massa di cellule senza colore (‘callo’) che attivano l’indifferenziazione cellulare per rigenerare tessuti danneggiati. Le cellule del callo vengono poi coltivate – individualmente o in gruppi (clusters), in base alle esigenze – in appositi terreni di coltura. A seguire, la descrizione del processo produttivo del primo candidato novel food da agricoltura cellulare in Unione Europea.
3.1) Formazione del callo
Il frutto della mela svizzera – nel caso del novel food in esame – viene tagliato in sezioni, alcune delle quali sono collocate su un medium di coltura solido costituito da saccarosio, vitamine, minerali e altri elementi, con agar per solidificare il terreno. Sono altresì presenti due ormoni vegetali denominati 6-benziladenina (BAP) e acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4 – D).
Il callo primario – costituito da cellule indifferenziate – viene così stimolato alla crescita continua. Alcune sue cellule selezionate vengono poi utilizzate per ottenere colture stock e colture di riserva conservate in forma surgelata, per sostituire gli stock con una frequenza approssimativa di 5 anni. Tutte le operazioni devono venire condotte in condizioni di assoluta sterilità.
3.2) Coltivazione delle cellule
Le cellule delle colture stock vengono trasferite in fiaschette da 500 ml ove lo stesso medium colturale è presente in forma liquida (i.e. senza agar). Esse si propagano a temperatura ambiente, con una leggera movimentazione, mantenendo sotto controllo i parametri essenziali (es. pH, volume della biomassa, contenuto di zucchero).
Una volta raggiunti i valori desiderati, il 10% circa in volume della fiaschetta è trasferito, sempre in condizioni di sterilità, all’interno di contenitori (biocontainers) usa e getta con volumi crescenti (e.g., 1 litro, 20 litri, 50 litri).
L’intero processo di coltivazione dura in media 3-4 settimane e viene considerato completato quando gli zuccheri presenti nel medium di coltivazione sono stati completamente metabolizzati dalle cellule coltivate.
3.3) Produzione dell’ingrediente
Il contenuto del biocontainer da 50 litri viene filtrato e risciacquato con una soluzione di cloruro di sodio (NaCl) al 0,9% (i.e. soluzione fisiologica), per venire poi miscelato in una soluzione al 15% di etanolo e omogeneizzato ad alta pressione (1.000 bar), così da permettere la rottura delle cellule. Segue un trattamento termico a 113 °C con un flusso d’aria di 300 kg/h.
La coltura cellulare – essiccata e polverizzata con un essiccatore a letto fluido – viene poi miscelata a isomalto, in modo da ottenere un prodotto che può venire conservato a temperatura ambiente.
4) Caratteristiche e specifiche del nuovo alimento
La composizione della biomassa ottenuta dalla coltura cellulare è risultata molto diversa – in termini di proteine, sodio e fibre – rispetto ai valori di riferimento indicati nel ‘consensus document’ di OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) sulle varietà di mele. (5)
Il richiedente ipotizza che tali differenze possano venire attribuite alle cellule sviluppate nel callo (proteine), il risciacquo con soluzioni di cloruro di sodio (sodio) e gli sforzi di taglio a cui sono state soggette le cellule durante la coltivazione (fibre).
Il novel food è costituito da una miscela di polvere di biomassa di coltura cellulare da mela (1.1 – 1.5%) e isomalto (98.5 – 98.9%) ottenuto da barbabietola da zucchero (Beta vulgaris var. saccharifera), che viene utilizzato come carrier per facilitare il trasporto e l’assorbimento della polvere nelle sedi interessate.
5) Ormoni di sintesi
Gli ormoni utilizzati per stimolare la indifferenziazione e proliferazione cellulare (i.e. 6-benziladenina e 2,4 – D) sono analoghi sintetici degli ormoni vegetali ‘auxina’ e ‘citochinina’. Essi vengono utilizzati molto, per questa funzione, anche in altre piante (es. azzeruolo, achillea, geranio). Nonché per stimolare la produzione di metaboliti come acidi organici, anti-ossidanti, polifenoli (6,7,8).
Queste sostanze – al pari dei pesticidi – sono soggette a ‘Maximum Residues Levels’ (MRLs), ai sensi del regolamento (CE) n. 396/2005 e sue successive modifiche. (9) Il loro utilizzo in agricoltura sono autorizzate per come fitoregolatori ed erbicidi (uso primario), rispettivamente, ai sensi del regolamento (CE) n. 1107/2009 sui prodotti fitosanitari. (10)
Nel caso in esame, la presenza di 6-benziladenina non è stata identificata mentre il 2,4-D è stato individuato a concentrazioni lievemente superiori ai MRL (tra 0,052-0,056 mg/kg) stabiliti per le mele fresche, che EFSA comunque considera non preoccupanti in relazione all’uso previsto.
6) Informazioni tossicologiche
Gli studi in vitro presentati dal richiedente per valutare la genotossicità del nuovo alimento – in parte replicati, per via delle interferenze dovute alla presenza dell’isomalto – non hanno mostrato motivi di preoccupazione di genotossicità dati dal nuovo alimento, alle concentrazioni testate.
Uno studio in vivo di tossicità orale su topi per 90 giorni è risultato invece inutilizzabile per la carenza di analisi composizionale del novel food e la mancata descrizione di alcuni endpoints. EFSA non ha peraltro ritenuto essenziale questo tipo di studio (sub-cronicità) per eseguire la valutazione del rischio.
7) Potenziale allergenicità
L’elevata concentrazione di proteine nel novel food è stata oggetto di particolare attenzione, poiché l’allergia da mela è una tra le più comuni tra quelle associate al consumo di frutti. Su richiesta dell’EFSA, il richiedente ha dovuto fornire una comparazione dell’espressione delle proteine nella biomassa prodotta con le proteine contenute nel frutto.
Un’analisi dell’ontologia genetica ha provato a caratterizzare meglio le 803 proteine che sono presenti nella biomassa e non anche nel frutto, ma le informazioni sulla proteomica della mela (Malus domestica) sono limitate e non è stato possibile approfondire appieno la natura e la funzione di queste proteine. È stato perciò concluso che tali proteine abbiano una potenziale allergenicità, che non è stata tuttavia confermata.
8) Precedente valutazione in Australia e Nuova Zelanda
Il candidato novel food è stato già valutato, nel 2020, dallo Advisory Committee on Novel Foods (ANCF) del Food Standards Australia New Zealand. (11) A seguito di tale valutazione, l’ingrediente è stato classificato in una categoria intermedia, in quanto ‘non-traditional food’ ma al contempo ‘not novel food’. (12)
FSANZ ha considerato l’assenza di problemi per la sicurezza alle condizioni d’uso proposte, fino a 10 mg/die in un prodotto costituito al 1-10% da coltura cellulare di mela e al 90-99% da isomalto. Le medesime condizioni erano già state considerate accettabili, nel 2017, per la sola polvere ottenuta dalle cellule del frutto.
9) Conclusioni provvisorie
L’opinione scientifica in esame, riferita a un ingrediente di origine vegetale, apre la strada all’approvazione in Unione Europea del primo alimento derivato da coltura cellulare. È ragionevole attendersi che questo percorso verrà seguito da altri operatori che lavorano alla produzione di ‘cell culture’ a base animale, sulla scia delle procedure di autorizzazione già portate avanti a Singapore e in USA. (13)
La pubblicazione del parere scientifico di EFSA ha richiesto quasi 40 mesi, ben oltre il periodo ordinario di 9 mesi previsto dal Novel Foods Regulation (EU) 2015/2283. Questo ritardo può venire in parte spiegato dall’attenzione dedicata alla valutazione della sicurezza. Ed è al contempo poco incoraggiante per chi investa in ricerca e sviluppo nel Vecchio Continente. (14)
Dario Dongo e Andrea Adelmo Della Penna
Note
(1) EFSA NDA Panel (2023) Safety of apple fruit cell culture biomass as a novel food pursuant to Regulation (EU) 2015/2283. EFSA Journal 21(7):8065, https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8065
(2) Aggarwal et al. (2020) Plant stem cells and their applications: special emphasis on their marketed products. 3 Biotech 10:291, https://doi.org/10.1007/s13205-020-02247-9
(3) Dario Dongo, Salvatore Parisi. Polifenoli e salute. I vegetali amici del sistema immunitario. GIFT (Great Italian Food Trade). 1.4.20
(4) PhytoCellTec™ Md Nu gains positive EFSA opinion as novel food. https://mibellebiochemistry.com/phytocelltectm-md-nu-gains-positive-efsa-opinion-novel-food
(5) OECD (2019) Safety Assessment of Foods and Feeds Derived from Transgenic Crops, Volume 3 – Common bean, Rice, Cowpea and Apple Compositional Considerations. OECD Publishing, https://doi.org/10.1787/f04f3c98-en
(6) Chaabani et al. (2015) Effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid combined to 6-Benzylaminopurine on callus induction, total phenolicand ascorbic acid production, and antioxidant activities in leaf tissue cultures of Crataegus azarolus L. var. aronia. Acta Physiol. Plant 37:16, https://doi.org/10.1007/s11738-014-1769-4
(7) Karhizi & Kakakei (2010) Effect of 6-Benzylaminopurine, 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid and Indole-3-Butyric Acid on Micropropagation Stages of Achillea biebersteinii. Asian Journal of Chemistry 22(3):2383-2386, https://asianjournalofchemistry.co.in/User/ViewFreeArticle.aspx?ArticleID=22_3_98
(8) Haensch (2007) Influence of 2,4-D and BAP on callus growth and the subsequent regeneration of somatic embryos in long-term cultures of Pelargonium x domesticum cv. Madame Layal. Electron. J. Biotechnol. 10(1):69-77, http://doi.org/10.4067/S0717-34582007000100007
(9) Il regolamento (UE) 2021/1841 ha stabilito un MRL complessivo di 0,01 mg/kg per la 6-benziladenina, mentre il regolamento (UE) 2022-1363 ha definito un MRL di 0,05 mg/kg, specifico per le mele
(10) Gli usi ammessi e i riferimenti ai periodi di autorizzazione e scadenza dell’autorizzazione sono riportati alla parte A (Sostanze attive considerate approvate a norma del regolamento (CE) n. 1107/2009, i.e. sostanze attive figuranti nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE), voce 317 e alla parte B (Sostanze attive approvate a norma del regolamento (CE) n. 1107/2009), voce 94 dell’allegato del regolamento (UE) n. 540/2011
(11) FSANZ. Record of views formed in response to inquiries. Updated July 2023. https://www.foodstandards.gov.au/industry/novel/novelrecs/Documents/Record-of-Views-updated-July-2023.pdf
(12) Le definizioni di ‘non-traditional food’ e ‘novel food’ sono contenute nella sezione 1.1.2-8 della norma 1.1.2 del Food Standard Code:
– ‘non-traditional food’ può avere i seguenti significati:
a) un alimento che non ha una storia di consumo umano in Australia o Nuova Zelanda, o
b) una sostanza derivata da un alimento, quando tale sostanza non ha ha una storia di consumo umano in Australia o Nuova Zelanda se non come componente di tale alimento, o
c) qualsiasi altra sostanza, se essa o la fonte da cui è derivata non ha una storia di consumo alimentare in Australia o Nuova Zelanda,
– il ‘novel food’ è un ‘non-traditional food’ che richiede una valutazione delle considerazioni relative alla salute pubblica e alla sicurezza, tenendo conto di:
a) potenziali effetti nocivi sugli esseri umani,
b) composizione e struttura dell’alimento,
c) processo mediante il quale il cibo è stato preparato,
d) fonte di provenienza,
e) modelli e livelli di consumo del cibo,
f) qualsiasi altra questione rilevante.
(13) Dario Dongo. Carne di pollo da agricoltura cellulare, via libera in USA e certificazione kosher. GIFT (Great Italian Food Trade). 19.9.23
(14) Va ricordato che EFSA (European Food Safety Authority) – negli undici anni dalla sua istituzione, prevista dal ‘General Food Law’ (Reg. EU No 178/02) – è stata investita di un’ampia serie di competenze in ogni ambito normativo che afferisca alla filiera agroalimentare. E il suo bilancio annuale è tuttora affidato dalle sole decisioni del Parlamento Europeo, senza che siano previsti contributi da parte degli Stati membri né degli operatori che si rivolgono all’Autorità. Lo stanziamento di adeguate risorse è perciò indispensabile a garantire la sicurezza alimentare in Unione Europea ma anche la competitività del settore.
Dario Dongo, avvocato e giornalista, PhD in diritto alimentare internazionale, fondatore di WIISE (FARE - GIFT – Food Times) ed Égalité.
Laureato in Tecnologie e Biotecnologie degli Alimenti, tecnologo alimentare abilitato, segue l’area di ricerca e sviluppo. Con particolare riguardo ai progetti di ricerca europei (in Horizon 2020, PRIMA) ove la divisione FARE di WIISE S.r.l. società benefit partecipa.
